DNA vyšetření

Na našem ústavu již 14 let existuje laboratoř DNA diagnostiky zabývající se vyšetřováním řady geneticky podmíněných onemocnění, jak na úrovni postnatální, tak i prenatální.

Od roku 1995 jsou na našem ústavu shromažďovány vzorky pacientů s tuberózní sklerózou (TSC) z celé ČR (frekvence onemocnění 1 : 10 000), v současnosti je to přes 100 rodin a problematikou se zabýváme jako jediné české pracoviště. Pro vyhledávání neznámých mutací v TSC genech je zavedena metoda DGGE a SSCP. K vazebné analýze je používáno vyšetření spočívající ve zjištění heterozygotní konstelace alel STR polymorfismů chromozomu č. 16 a 9. v DNA z periferní krve pacienta a jeho příbuzných. Pro odhalení redukce jedné z alel testovaných markerů v DNA izolované z hamartomatózní tkáně je zavedeno testování ztráty heterozygozity (LOH). V kapilární elektroforéze s využitím fluorescenčně značených dideoxynukleotidů jsou sekvenovány vzorky vytypované na základě SSCP a DGGE.

Od roku 1998 je u pacientek s Turnerovým syndromem prováděna diagnostika a kvantifikace Y-chromozomálních sekvencí v prevenci gonadálního tumoru, u pacientek a jejich rodičů je dale sledován přenos X chromozomu z rodičů na dítě pomocí testování chromozom X specifických STR markerů. Je sledována korelace zjištěných nálezů na genetické úrovni s klinickými projevy (stupněm neurokognitivní dysfunkce). Při řešení této problematiky bude řešen rovněž vliv mozaikového výskytu gonozomů (45X/46XX a 45X/46XY).

V roce 1999 bylo zavedeno vyšetřování infertilních pacientů na mikrodelece v oblasti AZF, které mohou vést k non-obstruktivní azoospermii nebo oligozoospermii. Pro detekci mikrodelecí bylo zavedeno testování deseti STS lokusů: SY16, SY72, SY84, SY86, SY87, SY134, SY143, SY147, SY255 (DAZ) a SY158. Pro usnadnění a zrychlení vyšetření byla vytvořena multiplex-PCR s fluorescenčně značenými primery pro lokusy SY87, SY147 a SY158.

V roce 2000 byl zahájen provoz genetického analyzátoru, který výrazně rozšiřuje a zpřesňuje DNA analýzu. S využitím genetického analyzátoru jsme se na našem pracovišti zaměřili na zavedení nové, rychlé a vysoce účinné metody - kvantitativní fluorescenční PCR (QF PCR) mikrosatelitní DNA pro testování polymorfních markerů lokalizovaných na chromozomech které se vyskytují v nejčastějších trizomiích. Tato metoda umožňuje rychlou detekci nejčastějších chromozomálních aberací bez kultivace fetálních buněk (odběr plodové vody či placentární biopsie s následnou kultivací a jejím chromozomálním vyšetřením trvá v 90 % 2 – 3 týdny). Nově zavedený postup patří k nejperspektivnějším metodám prenatální diagnostiky. Umožňuje odhalit aberace počtu chromozomů v ideálním případě do 4 hodin po odběru plodové vody z mikrokvant fetálních buněk bez jejich předchozí kultivace a podstatně tím zkrátit u pacientek dobu stresu.

Pro řešení paternitních sporů a identifikační účely provádíme DNA typizaci vyšetřováním mikrosatelitních markerů (STR). Jedná se o systémy, které vycházejí z mezinárodní databáze DNA profilů CODIS, používané americkým Federálním úřadem pro vyšetřování (FBI) i Evropským řetězcem forenzních vědeckých ústavů (ENFSI). S využitím těchto systémů lze bezproblémově uspokojit požadavky určování otcovství, neboť garantovaný paternitní index^* dosahuje hodnoty minimálně 500, zpravidla je však i o několik řádů vyšší. Takto určená pravděpodobnost otcovství je vždy vyšší než 99,8 %, většinou přes 99,99 %.

Z dalších molekulárně genetických vyšetření lze uvést:

Stanovení CAG expanze v diagnostice Huntingtonovy chorey

Hledání mutací v genu pro Connexin 26 u pacientů s poruchou sluchu

Testování základních mutací u pacientů s cystickou fibrózou

V roce 2004 byly zahájeny projekty:

1) Sledování dynamiky koncentrace apoptické a extracelulární fetální DNA v maternální plazmě (séru) v průběhu těhotenství a po porodu a cílená DNA analýza ploidie u normálních a patologických gravidit. Projekt se zabývá dynamikou koncentrace volné fetální DNA a fetálních apoptických buněk v maternální krvi. Využívá ověřených kvantitativních možností kapilární elektroforézy, citlivosti inovované techniky QF PCR a vhodné kombinace značení primerů.

2) Sledování vlivu sekvenční, repetiční a expresní variability genu TSPY na biologickou funkci v normálních a patologických buňkách (testikulární tumor, gonadoblastom, karcinom prostaty) a u mužů s poruchou plodnosti.